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如何养好细胞
作为不分白天黑夜、没有节假日（是的，春节也没有）学术型研究生3年专职养细胞、分离未知病毒的科研狗，分享一下“抚养”细胞的心得体会。 是的，核心提示，要像养孩子一样，充满爱心的去呵护你的细胞。
第一，洁净。
细胞间、培养箱、无菌操作，你能接触的每一步，都尽可能洁净就对了。 第二，适合。培养基、胰酶适合所培养的细胞系。 第三，传细胞时动作轻柔。
消化、分瓶、铺板等过程轻柔，不要产生气泡，否则细胞容易受损，影响细胞状态。 第四，也是最重要、最核心的，严格遵循细胞周期。能不能分离未知病毒，最重要的是细胞状态好，而细胞状态取决于传细胞的周期稳定。
如，三天传代就尽量三天传代，雷打不动。就跟人体一样，如果作息不规律（熬夜、昼夜颠倒），身体肯定疲惫、亚健康甚至生病，根本就谈不上状态好了。
细胞培养的方法有哪些
轻轻吹打,可先离心（1000rpm. 2,如要高浓度或需更换新培养基,新鲜培养基重悬沉淀,置培养瓶内轻轻摇晃: 1,吸的越干净越好,(根据配制强度经验),镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后. 一,然后收集离心（1000rpm 5min左右）,50ml培养瓶加入消化液约0；也可复苏当时离心（1000rpm 5min左右）后,以免中和后加入的消化液,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内,然后继续进行传代、传代培养首先进行细胞复苏,使细胞基本成单个悬浮,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞细胞培养首先分为原代培养和传代培养、冻存,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化,晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,24h后换液.贴壁细胞.6ml,加入完全培养基继续培养、原代培养需要从组织中消化,去除血清和死细胞,轻轻吹匀后.悬浮细胞,加入完全培养基后继续培养或实验: 对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,加入2-3ml完全培养基后,适时换液,按此比例进行消化.PBS清洗2-3次,使强度减弱,使细胞均匀后置培养箱内培养: 1,5min左右）后加入完全培养基,完全培养基重悬培养. 2.先将水温锅调至37-38度.应遵守慢冻快融的原则；二、纯化出单细胞、分离. 细胞传代: 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养如何更好的养细胞
对于好消化的细胞来说，完全不需要将细胞消化到漂起来、加培养基终止后离心，可以在消化到差不多快要脱落的时候，移除大部分trypsin，稍候片刻，直接加培养基将细胞吹打下来，省去离心步骤。残余的trypsin由于含量很低，所以不会对细胞产生任何影响。
b）对于难消化的细胞，我倒是建议用无钙镁PBS洗涤一次后，加入稍微多一点trypsin置37度彻底消化至脱落（一晃细胞就掉下来的那种），然后再加培养基终止、离心。
这么做的道理是，细胞消化不彻底，势必会增加吹打辅助脱落的次数。而吹打次数越多，细胞活性越差。值得注意的是，有些特殊的细胞，不可以使用trypsin作为消化液。比如我有一株纯由EGFRvIII基因驱动、不含其他生长因子信号通路基因突变的肿瘤细胞，用trypsin消化之后，形态会发生剧变，要等两天才能恢复。
经进一步实验发现，原来是trypsin剪切了EGFRvIII（室温2分钟就干掉20%的EGFRvIII）。而使用trypLE就不会有这种现象，相应地，流式数据提示仅丢失5%不到的信号。所以遇到比较脆的细胞，比如干细胞和一些肿瘤PDC，要测试一下何种消化液可用。
2、明白每一种细胞对营养物质的需求。我看过无数protocol使用PBS做细胞重悬、染色等活细胞实验的缓冲液。短时间的话，这并没有什么问题。
但是，经典的PBS配方中并不含葡萄糖、氨基酸等营养物质。因此，细胞在PBS中待的时间长的话，活性会受到极大的影响。我曾经做过一个实验，分别用PBS和HBSS（后者含葡萄糖）重悬同一份细胞样品，上流式进行单细胞分选到96孔板。
最后，HBSS组超过50%的孔长出克隆，而PBS组则低于5%。对于一些非常敏感的细胞来说，比如神经元，连洗涤都要使用含糖及其他营养物质的buffer。
植物细胞培养的方法有哪些
植物组织培养一般分为以下几种： 1、胚胎培养 指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。 2、器官培养 指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖、茎节和切段，叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶，花器的花瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养。
3、组织培养 指以分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。
这是狭义的植物组织培养。 4、细胞培养 指以单个游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。 5、原生质体培养。 指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养 组织培养的特点 1、培养条件可以人为控制 组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。
2、生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。
3、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。
饲养细胞制备方法
饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件。下面是我精心为你整理的饲养细胞制备方法，一起来看看。
饲养细胞制备方法 1、小鼠(一般选取经产母鼠)脱颈椎致死，注意断颈椎时尽量减少对腹腔的压迫，避免损伤腹腔内血管，以防饲养细胞内含有大量血细胞。
2、将小鼠浸泡于75%酒精中5—10分钟，然后手提住小鼠尾巴，上下于酒精中涮洗数次。置于超净台无菌平皿中。 3.用无菌剪镊从后腹剪开皮肤，沿两侧剪开皮肤，暴露腹部，注意不要损伤腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。
4.用注射器吸取6-8ml的不完全培养基注射入腹腔，注意注射时用镊子提起腹膜，避免针头刺到肠管等腹腔脏器。 5.用棉球轻轻按摩腹部一分钟，吸出注入的培养液。 6.800-1000 r/min离心5-10 min，弃去上清。
若腹腔血管损伤，沉淀中可见有红细胞。 7.用5mlHAT培养基悬浮细胞根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度达2×105/ml。(一般情况下一只经产母鼠可铺2-3块96孔板。
) 通对巨噬细胞来说，96孔板每孔需要2×104个细胞，24孔板需105个细胞。每只小鼠课的3-5×106个细胞，因此一只小鼠可供两块96孔板饲养细胞。 8.将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,37℃,6% CO2的培养箱培养。
单克隆抗体饲养细胞的制备 小鼠腹腔细胞含有巨噬细胞，除具有饲养作用外，还可清除死亡破碎细胞及微生物。取8～10周龄同系小鼠，断颈处死后，无菌操作腹腔内注射10～15ml完全培养液，用消毒拇指轻揉腹部数次后， 吸回腹腔液体，调整细胞浓度为1×105/ml。 一般一只小鼠腹腔液可获取细胞3～5×106，可供一次融合用。亦可取两只小鼠腹腔巨噬细胞混合使用。
此外，同系小鼠脾细胞和胸腺细胞亦可作为饲养细胞。 选择性培养 两种亲本细胞经PEG处理后，可形成多种细胞成分的混合体，包括未融合的游离亲本细胞、骨髓瘤细胞间的融合、免疫B细胞间的融合以及骨髓瘤细胞与免疫B细胞间融合的异核细胞，仅后者可形成杂交瘤，应予以筛选出来克隆培养。通常应用HAT培养液，其中含有次黄嘌呤H、氨基喋呤A和胸腺嘧啶核苷T。 大多数实验室在融合当天就加入HAT培养液，也可次日加入。
一般在融合后7～14天内使用HAT培养液，然后改用HT培养液。融合后第2～3周进行换液，每次吸出培养孔旧液1/2换入新液，以后视克隆生长情况3～5天换液1次，连续2周。3～5天后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡，1周左右可出现克隆，并不断增殖，当集落>3mm或布满孔底1/2时即可取上清作抗体活性检测，同时补加新鲜HT培养液。在一次较好的融合试验中，约70～80%孔有克隆生长。
所有生长克隆的孔都需要取培养上清液进行抗体活性检测。培养3周后即可改用普通完全培养液。
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